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技術(shù)文章

無(wú)基質(zhì)（Scaffold-Free）3D細(xì)胞球體的制備解析

技術(shù)文章
      細(xì)胞在體內(nèi)緊密的空間排列使得單個(gè)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間能夠進(jìn)行復(fù)雜的相互作用。這種排列為細(xì)胞提供了的線(xiàn)索，以指導(dǎo)特定的細(xì)胞功能和生長(zhǎng)。為了在體外復(fù)制這種空間排列，可以在三維（3D）培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)細(xì)胞，使細(xì)胞與細(xì)胞聚集形成球體。讓細(xì)胞聚集成細(xì)胞球體的無(wú)基質(zhì)（SCAFFOLD-FREE）3D細(xì)胞球體培養(yǎng)是構(gòu)建3D細(xì)胞球較為常見(jiàn)的方法。其原理基于貼壁細(xì)胞趨向于聚集的生物特性，如腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞等。



現(xiàn)階段，已有多種方法構(gòu)建細(xì)胞球體，如維持細(xì)胞在培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)（懸滴法、磁懸浮法、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法），或是利用低粘附孔板（U型板等）。不同的培養(yǎng)方法優(yōu)缺點(diǎn)是怎樣的？該如何選擇？相應(yīng)的3D細(xì)胞球體檢測(cè)和分析方法有哪些？本期，EFL從3D細(xì)胞球體的制備、檢測(cè)及應(yīng)用三方面進(jìn)行闡述，供大家參考與學(xué)習(xí)。


Scaffold-Free 3D 細(xì)胞球體制備方法



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1. 懸滴法
簡(jiǎn)介：細(xì)胞通過(guò)重力沉積在懸掛液滴的底部，并逐漸形成球狀體。將一小滴細(xì)胞懸液（體積為10-30μL）種植在微孔板的蓋子上，然后將微孔板倒置，使細(xì)胞在重力作用下積聚在液滴的底部。

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優(yōu)點(diǎn)：具有高通量制備細(xì)胞球狀體的潛力。
缺點(diǎn)：懸滴法通常涉及小體積液體操作，定期更換培養(yǎng)基和細(xì)胞染色都需要較高的實(shí)驗(yàn)操作技能。此外，它耗時(shí)且勞動(dòng)密集，難以實(shí)現(xiàn)3D多細(xì)胞球體的長(zhǎng)期培養(yǎng)。

2. 磁懸浮
簡(jiǎn)介：利用磁場(chǎng)將含有納米顆粒的氧化鐵細(xì)胞團(tuán)簇在一起形成球狀體。

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優(yōu)點(diǎn)：可控制細(xì)胞群的幾何形狀，能實(shí)現(xiàn)不同種細(xì)胞在共培養(yǎng)過(guò)程中的多細(xì)胞聚集。
缺點(diǎn)：細(xì)胞球體的大小和形狀難以控制，均勻性差。

3. 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)
簡(jiǎn)介：通過(guò)模擬微重力將細(xì)胞保持在動(dòng)態(tài)液體中。沿其水平軸旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器以混合細(xì)胞。通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)器的速度，可以將流體沖擊力和剪切力降至。形成3D細(xì)胞球體后，反應(yīng)器繼續(xù)以特定速度旋轉(zhuǎn)，以防止球體相互聚結(jié)。

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優(yōu)點(diǎn)：可模擬人體內(nèi)的動(dòng)態(tài)條件，適用于細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)，便于大規(guī)模生產(chǎn)等。
缺點(diǎn)：培養(yǎng)系統(tǒng)依賴(lài)性大，培養(yǎng)對(duì)象只能是各相同性的組織和器官，如軟骨、肝等，不適于各相異性的組織器官。

4. 超低粘附 U 型底多孔板
簡(jiǎn)介：非貼壁表面方法使細(xì)胞聚集成球狀體，盡可能的降低細(xì)胞貼附、蛋白吸收和酶活性，維持細(xì)胞以懸浮不貼壁的狀態(tài)生長(zhǎng)。

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優(yōu)點(diǎn)：非粘附表面培養(yǎng)方法方便簡(jiǎn)潔，可實(shí)現(xiàn)3D球體的長(zhǎng)期培養(yǎng)和異質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)。
缺點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞活性要求較高，并不適用于所有細(xì)胞形成細(xì)胞球。


細(xì)胞球體檢測(cè)方法



1. 形態(tài)分析
光學(xué)顯微鏡：可測(cè)量直徑、面積、周長(zhǎng)、固體度、圓度和球形度等屬性。
電子顯微鏡可以觀察到粗糙度、孔隙、通道和其他參與細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的結(jié)構(gòu)，存在結(jié)構(gòu)倒塌、制備和鍍金步驟導(dǎo)致球體形態(tài)發(fā)生變化的風(fēng)險(xiǎn)。
聚焦離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM)可自動(dòng)生成z軸分辨率較高的三維圖像，近年來(lái)已被應(yīng)用于大尺度三維球體成像。
透射電鏡技術(shù)則用于更詳細(xì)地分析球體中的超微結(jié)構(gòu)區(qū)室。

2. 細(xì)胞活力定性分析，用于三維內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細(xì)胞周期的表征
共聚焦激光掃描顯微鏡：可以觀察球體的不同層，對(duì)于光線(xiàn)穿透受阻的大球體的分析不太有效，可通過(guò)將球體冷凍切片來(lái)解決。然而，由于切割過(guò)程本身，切片可能會(huì)產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)的形態(tài)畸變，需要使用軟件工具將切片連接起來(lái)，重建完整的球體圖像。
光片熒光顯微鏡(LSFM)：不需要樣品切片就可觀察樣品3D結(jié)構(gòu)，能夠穿透更深的樣品。但雙光子的信號(hào)很弱，采集速度非常慢，不適合對(duì)大樣品進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像，其成本較昂貴。
雙光子和多光子顯微鏡系統(tǒng)：具有超高靈敏度的直接探測(cè)器能記錄組織深層最細(xì)微的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可有效地收集來(lái)自深層組織的微弱光子，使圖像更明亮。

3. 球狀體中活細(xì)胞的定量
球狀體中活細(xì)胞的數(shù)量可以通過(guò)直接方法(如手動(dòng)或自動(dòng)計(jì)數(shù))和間接方法(通過(guò)比色法和生物發(fā)光測(cè)定)來(lái)確定。
直接法：球體必須分解成單獨(dú)的細(xì)胞，這一過(guò)程的難度取決于組成球體的細(xì)胞類(lèi)型以及細(xì)胞產(chǎn)生的ECM的特征。
間接法包括比色法和生物發(fā)光法。比色法基于細(xì)胞攝取染色劑的能力，當(dāng)分離或聚集成球狀時(shí)，球體內(nèi)化合物擴(kuò)散的定量方法可能會(huì)顯示差異。生物熒光法被證明更可靠、更敏感、顯色化合物干擾更低、速度更快，因?yàn)椴恍枰旧珴摲?，而使用其他方法時(shí)可能需要幾個(gè)小時(shí)。

具體的檢測(cè)方法可參考往期EFL推文“細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)的“規(guī)矩"?總有一條適用你"

4. 基因表達(dá)譜
蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot可識(shí)別細(xì)胞裂解液中轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的存在，它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。

5. 細(xì)胞代謝
目前用于分析球形代謝功能的分析可以使用分析細(xì)胞外流的設(shè)備，并通過(guò)細(xì)胞外酸化率測(cè)量糖酵解，通過(guò)耗氧率測(cè)量氧化磷酸化。

6. 人類(lèi)細(xì)胞圖譜（HCA）
HCA方法，這項(xiàng)技術(shù)是提高圖像捕獲效率、圖像處理算法和開(kāi)發(fā)可靠的數(shù)據(jù)分析軟件的結(jié)果。HCA有潛力應(yīng)用于單個(gè)細(xì)胞、構(gòu)成球體的一組特定亞群或整體聚集的熒光標(biāo)記的分析，而不需要細(xì)胞分離。HCA需要自動(dòng)顯微鏡，通常是熒光或共聚焦顯微鏡，以及強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析和存儲(chǔ)軟件，這導(dǎo)致初始投資很高。


細(xì)胞球體應(yīng)用



1、藥物療效和毒性試驗(yàn):藥物篩選
2、器官發(fā)育和先天性疾病的探究
3、大規(guī)模組織工程的發(fā)展：生物制造
4、生物3D打印
5、增加系統(tǒng)復(fù)雜性:微流體和高通量平臺(tái)



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